单细胞测序服务器？微生物单细胞测序

SCS【2】单细胞转录组 之 cellranger

SCS【2】单细胞转录组之 cellranger

单细胞RNA测序技术的兴起极大地推动了基因表达研究的发展。面对日益增多的分析工具，理解并构建有效的单细胞分析工作流变得至关重要。cellranger，由10X Genomics公司推出的专用工具，简化了这一过程。它包括一套从数据预处理到下游分析的完整步骤，如mkfastq、count、multi、aggr和reanalyze，旨在处理不同类型的单细胞数据，如3'基因表达、细胞多路复用和固定RNA分析。

cellranger mkfastq：负责将Illumina测序仪生成的BCL文件转换为FASTQ文件，是bcl2fastq的增强版，专为10X Genomics样本格式设计。

cellranger count：处理FASTQ文件，执行对齐、过滤、计数和UMI分析，生成基因表达矩阵，适用于单样本或跨多个流单元的分析。

cellranger multi：处理Cell Multiplexing和Fixed RNA Profiling数据，支持特征条码数据分析。

cellranger aggr：聚合多个cellranger实例的输出，实现深度归一化和数据合并分析。

cellranger reanalyze：用于重新分析已有特征条形码矩阵，调整参数以优化分析结果。

根据样本、GEM孔和流式细胞的数量与类型，cellranger提供了多种工作流程示例，如单样本单GEM孔分析、多样本多GEM孔聚合等。对于复杂的数据类型，如多路复用和固定RNA分析，cellranger提供了专用的多管道处理。

为了开始分析，需从BCL文件开始，通过cellranger mkfastq进行转换，或直接使用已解码的FASTQ文件。每个工作流程的具体步骤在相关页面有详细指导。cellranger不仅提供了数据处理工具，还配合Loupe Cell Browser，帮助研究人员深入挖掘单细胞数据的生物学意义。

桓峰基因提供全面的cellranger支持，包括软件安装、参考数据和示例数据的获取。对于资源需求较高的服务器操作，桓峰基因提供专业的服务协助。未来，桓峰基因公众号将持续发布单细胞系列生信分析教程，敬请关注。

单细胞测序中Aspera Connect和 SRA ToolKit下载及其安装

单细胞测序技术中，Aspera Connect和SRA Toolkit是常用的下载工具，以下是它们的下载和安装方法。

### Aspera Connect安装

首先，使用wget下载Aspera Connect软件包：

wget download.asperasoft.com...

然后解压缩下载的文件：

tar zxvf aspera-connect-3.7.4.147727-linux-64.tar.gz

接下来，运行安装脚本：

bash aspera-connect-3.7.4.147727-linux-64.sh

安装完成后，检查根目录下是否存在.aspera文件夹，确认安装成功。

cd&& ls-a

将aspera软件加入环境变量并激活：

echo'export PATH=~/.aspera/connect/bin:$PATH'>>~/.bashrc

source~/.bashrc

最后，检查ascp命令是否可用：

ascp--help

### SRA Toolkit下载及其安装

1、使用wget下载对应版本的SRA Toolkit：

wget-P~/Biosofts/ ftp-trace.ncbi.nlm.nih.gov...

2、使用tar命令解压缩文件：

tar zvxf~/Seqs/sratoolkit.2.9.2-ubuntu64.tar.gz-C~/Biosofts

3、测试安装是否成功：

~/Biosofts/sratoolkit.2.9.2-ubuntu64/bin/fastq-dump-h

4、将sratoolkit安装文件路径加入环境变量：

echo'export PATH=~/Biosofts/sratoolkit.2.9.2-ubuntu64/bin:$PATH'>>~/.bashrc

source~/.bashrc

5、再次测试sratoolkit安装情况：

fastq-dump

prefetch-h

如果要下载数据，如SRR文件，直接加ID号，指定输出目录：

prefetch SRRxxxxxxx-O PATH

###数据下载

利用ascp从ftp.ncbi下载测序数据：

ascp-QT-l 300m-i~/.aspera/connect/etc/asperaweb_id_dsa.openssh era-fasp@fasp.sra.ebi.ac.uk:vol1/srr/SRR772/007/SRR7722937./

ascp-QT-l 300m-i~/.aspera/connect/etc/asperaweb_id_dsa.openssh era-fasp@fasp.sra.ebi.ac.uk:vol1/srr/SRR772/008/SRR7722938./

ascp-QT-l 300m-i~/.aspera/connect/etc/asperaweb_id_dsa.openssh era-fasp@fasp.sra.ebi.ac.uk:vol1/srr/SRR772/009/SRR7722939./

ascp-QT-l 300m-i~/.aspera/connect/etc/asperaweb_id_dsa.openssh era-fasp@fasp.sra.ebi.ac.uk:vol1/srr/SRR772/000/SRR7722940./

ascp-QT-l 300m-i~/.aspera/connect/etc/asperaweb_id_dsa.openssh era-fasp@fasp.sra.ebi.ac.uk:vol1/srr/SRR772/001/SRR7722941./

ascp-QT-l 300m-i~/.aspera/connect/etc/asperaweb_id_dsa.openssh era-fasp@fasp.sra.ebi.ac.uk:vol1/srr/SRR772/002/SRR7722942./

使用wget下载其他文件，如cellranger count命令：

cellranger count--id=nohup\

--transcriptome=/home/ym/opt/refdata-gex-GRCh38-2020-A\

--fastqs=/home/ym/opt\

--sample=mysample\

--expect-cells=1000\

--nosecondary

服务项目：

【生信热点文献思路复现】

【临床预后模型方案设计】

【生信&实验结合方案设计】

【数据库构建】

【共享1024G存储生信服务器】

【35篇原创代码合集】

示例报告：

【数据分析报告】单基因在肿瘤中的生信分析

【数据分析报告】疾病药物代谢相关基因与肿瘤免疫、预后关系探讨

往期精彩：

1、新热点-m5C合集

2、单基因生信分析套路

3、非肿瘤类纯生信文献解读

4、为何常规纯生信文章频频被拒？

使用ArchR分析单细胞ATAC-seq数据(第一章)

这一章介绍了导入数据和构建Arrow文件的基础知识，为后续的ArchR分析提供了必要步骤。首先，我们深入了解了ATAC-seq术语中“fragment”的概念，它是通过Tn5转座酶对DNA分子进行酶切后，通过双端测序获得的序列。在进行ATAC-seq实验时，Tn5分子结合到DNA上，两个分子之间相隔9bp，每个Tn5同源二聚体结合事件会产生两个插入，中间相隔9bp，真实“开放”位置的中心位于Tn5二聚体的正中间。为还原实际情况，会对Tn5的插入结果进行校正，即正链往右移动4bp，负链往左偏移5bp。在ArchR中，“fragment”和“insertions”指的是经过校正后的单碱基起始和结束位置，以及单碱基位置，与细胞条形码一一对应。

ArchR项目的选择主要源于其提供的功能和其他工具的局限性。ArchR优化了数据结构，降低了内存消耗，提升了运行速度，使其在处理超过70,000个细胞的项目时，内存需求低于其他同类型工具。它最初设计用于MacBook Pro，针对中等大小的实验（少于100,000个细胞），能够实现特殊分析的快速运行并实时展示结果，便于深入的生物学解释。对于大型数据集，建议使用服务器进行分析。

在ArchR中，数据通过Arrow文件进行管理。每个Arrow文件记录了独立样本的所有信息，包括元数据、开放的fragment和数据矩阵。独立样本是分析的基本单元，最好具有详尽的分析内容，如特定条件下的单个重复。创建Arrow文件时，会编辑和更新相关文件，添加额外信息层。Arrow文件实际上是磁盘上的HDF5文件路径，而不是内存中的R对象。通过ArchRProject对象，可以关联多个Arrow文件到单个分析框架中，方便在R环境中访问，且内存占用少。

ArchR主要接受scATAC-seq原始数据的两种常见输出格式：BAM文件和fragment文件。BAM文件是二进制格式下的排序文件，记录了片段、原始数据和细胞条形码等信息。fragment文件记录了片段以及对应的细胞ID。选择何种文件取决于上游处理流程，例如10XGenomics的CellRanger软件输出的是fragment文件，而sci-ATAC-seq流程则输出BAM文件。ArchR提供了读取这两种文件的函数，采用分块处理方法高效读取大文件，同时避免内存消耗过多。

在进行ArchR分析前，需要进行一些准备工作，包括设置工作目录、使用线程数、加载基因和基因组注释。根据个人环境的不同，可能需要调整线程数，ArchR默认使用系统一半的可用线程。对于Windows系统，线程数默认为1，因为ArchR的多线程依赖于Unix系统。安装ArchR和相关包的过程较为复杂，涉及从GitHub下载项目，然后在R中安装，同时确保安装额外的必需包。在完成安装后，加载ArchR包，设置默认线程数，以及选择适当的基因组注释版本，以确保分析的准确性和一致性。此外，还需要创建自定义的基因组注释，以适应特定的数据集或物种。

创建Arrow文件是ArchR分析流程的重要步骤，通过将片段数据与元信息整合，生成用于后续分析的高效数据结构。在创建过程中，会自动添加基本的元信息和矩阵，如TileMatrix和GeneScoreMatrix。为确保分析质量，需要进行严格的数据质控，包括检查唯一比对数、TSS富集得分以及片段大小分布，以剔除低质量细胞。最终，通过这些步骤，为后续的单细胞ATAC-seq数据的深入分析奠定了坚实的基础。